L-谷氨酰胺广泛存在于自然界，例如，以游离状态含于南瓜、向日葵的幼苗中，其N-乙基化合物（茶氨酸，theanine）含于茶叶中。虽然可自天然产物提取谷氨酰胺，但大量生产则采用发酵法和合成法。

合成法

由L-谷氨酸-5-甲酯（[1499-55-4]）经缩合、加成、成盐、水解而得。谷氨酸在浓硫酸存在下与甲醇酯化，所得的酯化液滴加入甲醇和二硫化碳的混合液中，一边滴加，一边在冷却下通氨。酯化液滴加完后，继续通氨，然后加入三乙胺，在30℃密闭放置40h。经减压浓缩赶氨后，得γ-甲酯-L-谷氨酸-N-氨荒酸二铵盐浓缩液。将其加热至40-45℃，加入乙酸。搅拌30分钟后，减压除去二硫化碳，此时析了大量结晶。然后加入等体积甲醇，于0℃放置12h，过滤，得谷氨酰胺粗品。经活性炭脱色、重结晶得成品。

发酵法

将葡萄糖或乙酸、乙醇作为培养基碳源，用黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）菌种发酵，以葡萄糖计产率为39g/L，收率为39%。